Moderna mRNA疗法研究中新技术运用-Digital Western案例分享

RNA药物治疗领域近年来取得了快速进展，特别是mRNA新冠疫苗带动了整个领域发展进步，更多mRNA疗法进入到临床试验阶段。美国Moderna公司作为mRNA疗法领域的领导者，在9月份研发日活动上，除了mRNA疫苗领域临床开发进展外，重点介绍了mRNA疗法作为酶替代疗法的概念验证和临床进展。目前在研临床I/II期mRNA疗法mRNA-3927用于治疗丙酸血症（Propionic acidemia，PA）。丙酸血症是一种线粒体酶丙酰辅酶A羧化酶(PCC)缺乏引起固有代谢紊乱，PCC由六个α(PCCA)和六个β(PCCB)亚基组成，采用双mRNA递送方式可帮助细胞在体内合成有活性的PCC酶。

作为mRNA酶替代疗法，需要在细胞内表达相关蛋白酶，在体外和体内实验中都需要准确定量细胞内蛋白质表达量和mRNA用量之间关系。现有的细胞内蛋白质表达定量检测技术如Western blot、ELISA、LC-MS等都有改进空间，全自动毛细管电泳Digital Western技术（Simple Western）作为细胞内蛋白质表达定量领域的创新性工具，被Moderna用于mRNA药物发现和临床前研究阶段，加速推进mRNA药物研发。

mRNA-3927临床前小鼠动物模型研究表明，双RNA疗法可恢复代谢功能。采用编码人类PCCA和PCCB的双mRNA组合，装载在可生物降解脂质纳米颗粒（LNP）中，在肝中可产生功能性PCC酶。Digital Western分析检测患者来源成纤维细胞和人Hep3B细胞线粒体内蛋白质表达。患者成纤维细胞内双mRNA转染导致PCC酶活性和蛋白质亚基剂量依赖性增加。双mRNA编码蛋白质比单独mRNA具有更高的PCC酶活性，高出5-24倍。下图a-c是比较双RNA共转染与hPCCA或hPCCB mRNA单独转染数据。a和d图是酶活性评估，两种mRNA编码PCC蛋白亚基都有助于增加PCC活性，产生最高PCC酶活性的最佳摩尔比为1:1。b和c图是采用毛细管Digital Western定量检测患者成纤维细胞中PCCA和PCCB蛋白质表达。

本研究同时采用毛细管电泳Digital Western评估小鼠组织中氧化蛋白标志物表达变化，如肝脏、心脏和大脑中氧化标志物表达水平变化，如过氧化氢酶(CAT)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶1(OGG1)和亲环蛋白D(CypD)。5个月和10个月大PA亚型和野生型小鼠对比研究，PA亚型小鼠的氧化蛋白标志物轻微改变（<1.5倍），从而导致较轻微的线粒体功能障碍。这些器官中线粒体基因组没有显著差异。

Citrin缺乏症是SLC25A13基因突变导致的神经遗传代谢病，是一种常染色体隐性遗传疾病。成人II型瓜氨酸血症（Type II citrullinemia ，CTLN2)是SLC25A13基因突变引起的疾病，其编码肝脏特异性线粒体天冬氨酸/谷氨酸转运蛋白，称为Citrin，位于线粒体内膜上，其主要功能是讲天冬氨酸由线粒体转运到细胞质内，同时将细胞质内谷氨酸和质子转运到线粒体内，协同瓜氨酸参与尿素合成。由于药物递送障碍，传统蛋白质替代疗法不是患者选择，AAV基因治疗也有免疫原性等问题，目前唯一治愈方法是肝移植。

作者研究了一种新的治疗citrin缺乏症的mRNA疗法，采用一系列编码人citrin（hCitrin）蛋白的mRNA分子，在体外各种细胞系内和体内citrin缺陷小鼠模型中研究hCitrin-mRNA有效性。

Digital Western检测hCitrin-mRNA转染的哺乳动物细胞系中Citrin蛋白表达水平，HeLa、HepG2和CTLN2患者成纤维细胞中Citrin蛋白高效表达。

通过相关研究证明了在人类细胞系和citrin缺乏的小鼠模型上，hCitrin-mRNA-LNP疗法对citrin缺乏症 的治疗可能具有显著疗效。

进行性家族性肝内胆汁淤积症3型（Progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 ，PFIC3)是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，由编码磷脂酰胆碱转运蛋白 (ABCB4/MDR3) 的 ABCB4 基因功能丧失变异引起。哈佛大学医学院和Moderna公司联合研究团队，采用系列hABCB4-mRNA变体在细胞模型和PFIC3小鼠模型上进行药理实验。

为了提高mRNA表达hABCB4蛋白水平，采用密码子优化方法增强蛋白质表达已达到治疗目的。采用Moderna内部开发算法产生了13个独立的密码子优化的hABCB40mRNA变体（V1-V13），瞬时转染HEK293细胞后定量检测hABCB4蛋白表达水平。与WT序列相比，大多数优化hABCB4-mRNA变体导致蛋白质表达效率明显提高，hABCB4v6-mRNA变体具有最高蛋白表达和相关活性。靶向肝脏hABCB4-mRNA疗法可实现功能性hABCB4蛋白从头表达，并在培养细胞内和PFIC3小鼠肝脏中恢复磷脂转运，重复注射可挽救年轻Abcb4-/-小鼠的疾病表型。本研究临床前概念验证了mRNA治疗可作为PFIC3疾病潜在治疗途径。

全自动毛细管Digital Western技术作为创新性毛细管电泳免疫学技术，将Western Blot技术和ELISA技术合二为一，具备传统WB可视化定性优势，同时具备ELISA免疫学实验精准定量能力，其灵敏度和精密度符合高标准生物分析要求，可利用微量组织样本实现内源性蛋白质精准定量。此技术已广泛被核酸药物领域领导者采用，如mRNA药物Moderna、BioNtech和CureVac等，ASO药物Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等，siRNA药物Alnylam、Dicerna和Arrowhead等，saRNA领域MiNA Therapeutics和中美瑞康等，及其他各种RNA疗法公司。

1)Digital Western技术适合RNA疗法体外和体内各种模型中靶蛋白表达定量分析，适用于细胞系、类器官模型、小动物模型和非人灵长类动物模型的关键蛋白质定量分析。

2)Digital Western技术样本量需求是传统技术几十分之一：只需要3μL样本就可实现多重蛋白质表达检测，特别适合微量珍贵样本。

3)Digital Western可精准定量

：RNA疗法研发中，从体外细胞水平实验到体内组织水平，建立RNA药物与蛋白质表达水平的量效关系和时效关系曲线，特别是靶蛋白水平作为生物标志物与疗效相关联时。

4)符合核酸药物行业对自动化、标准化和效率的需求：Digital Western技术实现了全自动化和标准化，软件符合FDA 21 CFR Part 11合规性需求。系统3个小时获得一批实验结果，大大提高了实验效率，同时减少人力成本。面对行业激烈竞争，迫切需要提升核酸药物研发效率，Digital Western技术已成为RNA疗法研发实验室标准配置。